Amplikonsequenzierung

Die Sequenzierung von Amplikon-Bibliotheken ist eine effektive Methode zur taxonomischen Profilierung mikrobieller Gemeinschaften über unterschiedliche Markergene, z.B. 16S rRNA, 18S rRNA oder ITS. Im medizinischen Bereich wird die Amplikonsequenzierung verwendet für die Detektion von seltenen genetischer Varianzen, z.B. bei Erbkrankheiten. Wir bieten Ihnen eine individuelle Projektplanung und das passende Primerdesign für das Markergen ihrer Wahl. Auf Wunsch generieren wir auch das entsprechende Amplikon mit unseren empfohlenen Primern oder sie schicken uns ihre PCR-Produkte mit eigenen Primern generiert, die den Adapter-Überhang haben. Hierbei ist für sie natürlich zu beachten, dass das Produkt, wenn es überlappend sequenziert werden soll, nicht größer als 550 bp ist. Generell sind PCR-Produkte von 380 bp bis maximal 700 bp möglich. Durch Hochdurchsatz-Sequenzierung und Anwendung unserer Analyse-Pipeline erhalten sie die nötigen taxonomischen und/oder statistischen Daten.

 

Illumina Amplikon Sequenzierung

Aufgrund langer Leseweiten durch Zusammenfügen von überlappenden Paired-End Reads und hoher Datenqualität ist die Sequenzierung von Amplikons auf dem Illumina MiSeq erste Wahl. In Abhängigkeit der Zielsetzung ihres Experimentes und der Probenzahl unterstützt das System unterschiedliche experimentelle Ansätze.

Die klassische Amplikongenerierung erfolgt unter Verwendung von zwei PCR-Reaktionen. In der ersten PCR wird ein locusspezifischer Primer mit Überhang für einen Ilumina-Adaptor verwendet. Die Fusionsprimer setzen sich aus dem A- bzw. B-Adaptor für die Illumina, dem Sequenzierschlüssel, einer MID (Multiplex Identifier) und der template-spezifischen Sequenz zusammen. In der zweiten PCR erfolgt die Hybridisierung der Adaptorsequenzen (s. Abbildung Beispiel bei Illumina) Danach sind die Proben bereit für die Sequenzierung.

 

1. PCR: Locusspezifischer Primer mit Adapter-Überhang

 

2. PCR: Adapter-Hybridisierung (vereinfachte Darstellung)

 

Zur Adaptierung ihrer bereits existierenden PCR-Produkte stehen ihnen zur Sequenzierung bei Illumina 96 verschiedene Barcode-Adapter zur Verfügung. Bei diesem experimentellen Ansatz ist zu bedenken, dass die Fragmente in beiden Orientierungen an die Library Adapter binden, so dass die Sequenzierung der Fragmente ungerichtet stattfindet.

 
Für die meisten experimentellen Ansätze empfiehlt sich eine bidirektionale Paired-end Sequenzierung auf dem Illumina MiSeq, weil die Kombination aus Vorwärts- und Rückwärtsread mehr Konsensussequenz erzielt und präzisere Varianzdetektion ermöglicht.